Распределительная хроматография на бумаге. Распределительная хроматография Методы бумажной хроматографии
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Хроматография ОФС.1.2.1.2.0002.15
на бумаге Взамен ст. ГФ XI , вып.1
Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы, называется хроматографией на бумаге.
Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, предварительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным или адсорбционным. Перемещение подвижной фазы происходит либо только под действием капиллярных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).
При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бумаге зоны адсорбции в виде круглых или овальных пятен или полос в зависимости от способа нанесения (в точку или полосой). Совокупность зон адсорбции, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хроматограммой.
Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется фактором удерживания R f , (см. ).
Область применения
Бумажная хроматография может использоваться для установления подлинности, чистоты и количественного определения анализируемого вещества.
Подлинность подтверждается при одновременном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стандартного вещества. Если образцы идентичны, то соответствующие им зоны адсорбции на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения R f . Для идентификации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно наблюдаться одно пятно, характеризующее зону адсорбции. Условия хроматографирования следует подбирать так, чтобы значения R f были отличны от 0 и не превышали 1. Кроме того, для подтверждения подлинности анализируемого вещества могут быть использованы конкретные условия его детекции, указанные в фармакопейной статье.
При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения R f . О степени чистоты анализируемого вещества можно судить по величине и интенсивности окраски (или поглощения) обнаруживаемых на хроматограмме зон адсорбции примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бумаги одновременно хроматографируют определенное количество анализируемого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее зону адсорбции на хроматограмме по совокупности площади зоны адсорбции и интенсивности окраски (или поглощения) с зонами адсорбции свидетеля.
Для количественного анализа применяют специальные приборы, позволяющие проводить измерения в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для обработки хроматограмм в видимой области спектра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.
можно также проводить количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого зоны адсорбции вырезают и экстрагируют определяемое вещество подходящим растворителем. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом, пригодным для определения малых концентраций и учитывающим строение анализируемого вещества.
Проба испытуемой смеси может наноситься либо точечно на линию старта, либо в виде равномерной полосы вдоль всей линии старта, при этом первичная зона адсорбции будет иметь вид пятна, а во втором случае – полосы, параллельной линии старта.
Оборудование
Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизированные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие наблюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришлифованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.
При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, однократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать ширину листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена устройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем положении и для ввода в лодочку подвижной фазы.
При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу помещают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо наливают на дно камеры.
Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворителей, входящих в состав подвижной фазы.
Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в фармакопейных статьях.
Методики хроматографического разделения
Бумажная хроматография может быть одномерной и двумерной.
Одномерная бумажная хроматография предполагает точечное нанесение или нанесение в виде полосы пробы исследуемой смеси на линию старта и последующее хроматографирование в одном направлении (рис. 1).
Рисунок 1 – Примерная схема одномерной бумажной хроматографии
Двумерная хроматография предполагает последовательное прохождение подвижной фазы в двух перпендикулярных направлениях, что позволяет обеспечить более четкое разделение смеси анализируемых веществ (рис. 2).
Рисунок 2 – Примерная схема двумерной бумажной хроматографии
Нисходящая хроматография
На дно хроматографической камеры помещают неподвижную или подвижную фазу в количестве, достаточном для образования слоя глубиной 2,5 см. Камеру закрывают и оставляют для насыщения на 24 ч при постоянной температуре. В отдельных случаях, при использовании достаточно летучих растворителей, это время может быть сокращено.
Растворы веществ наносят на линию старта микропипеткой или микрошприцем так, чтобы расстояние между точками нанесения отдельных проб было не менее 3 см. Если минимальное, необходимое для проведения хроматографирования количество анализируемого раствора может образовывать на бумаге первичную зону адсорбции в виде пятна, превышающего в диаметре 10 мм, нанесение проводят в несколько приемов, предотвращая путем подсушивания чрезмерную диффузию на линии старта. После нанесения растворов анализируемых веществ и высыхания образовавшейся при этом первичной хроматограммы полосу бумаги закрепляют в рабочем положении в камере и оставляют на 1,5 ч. В рабочем положении полоса хроматографической бумаги должна висеть вертикально так, чтобы между ее верхним концом, погруженным в лодочку, и линией старта был лишь один, по возможности плавный, перегиб. По окончании выдержки начинают хроматографирование, для чего в лодочку вливают подвижную фазу. Хроматографирование обычно заканчивают при приближении фронта подвижной фазы к нижнему концу полосы бумаги. Если в фармакопейной статье нет специальных указаний, полосу вынимают из камеры и сушат на воздухе, отметив графитовым карандашом конечное положение фронта подвижной фазы. Детекцию зон адсорбции осуществляют согласно указаниям фармакопейной статьи.
Восходящая хроматография
Для проведения восходящей хроматографии на бумаге используют камеры, в которых сосуд (лодочка) с подвижной фазой располагается в нижней части или на дне. Полоса хроматографической бумаги закрепляется в верхней части камеры так, чтобы обеспечить возможность погружения нижнего конца полосы в лодочку с подвижной фазой. В рабочем положении полосы линия старта должна отстоять от поверхности подвижной фазы на 2 – 3 см. В остальном приемы работы при проведении восходящей хроматографии на бумаге не отличаются от описанных выше.
Подготовка фаз и бумаги
При приготовлении несмешивающихся систем растворителей, совместно используемых при хроматографии в качестве подвижной и неподвижной фазы, необходимо обеспечить их взаимное насыщение, например, путем встряхивания в делительной воронке. При этом в фармакопейной статье должно быть указано, какую из фаз используют для хроматографирования.
Фильтровальную бумагу нужной плотности квалификации «для хроматографии» разрезают в направлении, перпендикулярном или параллельном волокнам, на листы (полосы), длина которых приблизительно равна высоте камеры. Ширина этих полос может быть приблизительно определена по формуле: А = 3(К + 1), где А – ширина полосы (см), К – количество хроматограмм на полосе.
На каждой полосе бумаги для обозначения мест нанесения хроматографируемых веществ графитовым карандашом проводят прямую линию, называемую линией старта. Расстояние от конца полосы бумаги до линии старта выбирается так, чтобы при погружении бумаги в лодочку исключалось непосредственное соприкосновение нанесенных на линию старта веществ с жидкостью, находящейся в лодочке.
На приготовленные таким образом листы фильтровальной бумаги, если указано в фармакопейной статье, наносят неподвижную фазу. Для этого соответствующие труднолетучие растворители (формамид, пропиленгликоль и т.п.) смешивают с легколетучими растворителями и в полученную смесь на 1 – 2 с погружают подлежащие обработке листы бумаги. Избыток смеси с поверхности листов снимают, обжимая их между двумя слоями фильтровальной бумаги, после чего летучий компонент смеси удаляют высушиванием на воздухе в течение 15 – 20 мин.
Если в качестве неподвижной фазы рекомендован водный раствор нелетучих веществ, то бумагу обрабатывают этим раствором, сушат, как указано выше, а перед хроматографированием выдерживают в камере, содержащей пары воды. Нанесение на бумагу легколетучих компонентов неподвижных фаз осуществляется путем выдерживания ее в парах фазы в камере непосредственно перед хроматографированием.
Детекция зон адсорбции
По окончании хроматографирования хроматограммы подсушивают до удаления следов растворителей и просматривают в видимом или ультрафиолетовом свете (при определенной длине волны детектора, указанной в фармакопейной статье), отмечая при этом зоны адсорбции. В ряде случаев для обнаружения зон адсорбции хроматограмму подвергают обработке специальными реагентами, образующими с анализируемыми веществами окрашенные продукты реакции, путем опрыскивания или погружения в раствор реагента.
Способ детекции зон адсорбции должен быть обязательно указан в соответствующей фармакопейной статье на лекарственное средство.
При бумажной хроматографии неподвижной жидкой фазой служит вода, адсорбируемая волокнами бумаги в количестве до 20%, ил другой полярный растворитель; в качестве подвижной фазы чаще всего применяют бутиловый спирт, коллидин, фенол, крезолы. Носителем служит хорошая фильтрованная бумага, достаточно однородная по толщине и плотности.
Для разделения смеси способом бумажной хроматографии каплю исследуемого раствора наносят на полоску фильтрованной бумаги шириной 15-20 мм и длиной 300-500 мм на расстоянии 20-30 мм от конца. Конец полоски погружают в соответствующий органический растворитель, предварительно насыщенной водой, а весь прибор помещают в герметическую камеру, атмосфера в которой насыщена парами органического растворителя и воды. Движение растворителя вдоль полоски бумаги, происходящее вследствие капиллярных сил, обеспечивает проявление хроматограммы, причем отдельные зоны перемещаются с различной скоростью.
Двумерная хроматография на бумаге
Еще более точные результаты получаются при помощи так называемой двухмерной хроматографии на бумаге. Для этого варианта применяют не полоски фильтрованной бумаги, а прямоугольники размером примерно 400Х500 мм. Каплю исследуемого раствора наносят вблизи одной из вершин прямоугольника, а Хроматограмму проявляют дважды различными растворителями, например фенолом и коллидином, сперва одним растворителем, а затем, после поворота на 90?, -другим.
Методы проявления хроматограмм
Восходящая хроматография. Бумага погружается нижним концом в подвижную фазу. Подъём жидкости происходит под действием капиллярных сил.
«+» Прибор прост, возможна количественная оценка результатов;
«-» Сила тяжести и капиллярные силы действуют в противоположных направлениях; скорость всасывания после подъема до 20 см сильно падает. Применима для веществ, имеющих достаточно большие различия в значениях Rf
Нисходящая хроматография. Бумага погружается в подвижную фазу верхним концом. Стекание жидкости происходит под действием силы тяжести.
«+» - быстрое прохождение подвижной фазы; отсутствие ограничения длины пробега пятен (проточная хроматограмма); возможно разделение веществ с незначительно отличающимися значениями Rf и количественная оценка результатов.
«-» - Прибор сложнее, чем для восходящей хроматографии.
Рис. 5.
Радиально-горизонтальная хроматография. Подвижная фаза непрерывно наносится в центр круглого листа бумаги.
«+» - Быстрое выполнение, зоны узки и резко очерчены; большая полнота разделения, чем для первых методов.
«-» - Возможна только качественная оценка результатов; применение «свидетелей» возможно только лишь при так называемом «секретном методе» (т.е. при делении бумаги на секторы).
Приготовление подвижной фазы
Ниже описан простейший случай хроматографии на бумаге - восходящая хроматография с водой в качестве восходящей фазы.
Компоненты выбранной системы растворителей смешивают в указанном соотношении в делительной воронке. Две несмешивающиеся фазы доводят при помощи встряхивания до взаимного насыщения; в качестве подвижной фазы выступает органическая.
Нанесение вещества
Из бумаги определенного сорта вырезают полоску, размер которой соответствует размерам применяемого для хроматографии цилиндра. На расстоянии 3 см от нижнего края карандашом наносят маркировочную линию. На этой линии через 2 - 2,5 см друг от друга и от краев полоски помечают точки старта. Специальной пипеткой наносят каждую точку старта; при этом образуются пятна около 1 см в диаметре. Затем растворителю дают испариться.
тонкослойный хроматография растворитель бумага
Проявление
На дно цилиндра наливают подвижную фазу и подвешивают полоску бумаги. Оставляют ее так висеть в течение ночи, а затем нижний край полоски погружают на 0,5 см в подвижную фазу. После того как растворитель поднимется на 20 - 25 см, полоску вынимают, отмечают карандашом положение фронта растворителя и Хроматограмму высушивают.
Вместо пластинок с нанесенным тонким слоем сорбента можно использовать специальную хроматографическую бумагу в виде листов или полосок. Хроматографическая бумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижной фазе и быть однородной по плотности; имеют значение структура молекул целлюлозы в бумаге, ориентация волокон и другие свойства, влияющие на скорость движения подвижной фазы. Основные операции в бумажной хроматографии проводятся примерно так же, как и в тонкослойной.
Для разделения водорастворимых веществ, например, неорганических ионов, в качестве подвижной фазы обычно берут органический растворитель, а в качестве неподвижной – воду (бумагу заранее смачивают водой). Для разделения компонентов, хорошо растворимых в органических растворителях, гидрофильную бумагу превращают в гидрофобную, пропитывая ее растворами органических веществ (парафина, растительного масла и др.), а в качестве подвижной фазы используют воду, водный раствор какой-либо кислоты или щелочи, буферный раствор.
Растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворители должны легко удаляться с бумаги. Индивидуальные растворители используются достаточно редко. Чаще для этой цели применяют смеси веществ, например, бутилового или амилового спирта с метиловым или этиловым, смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком и др.
По технике выполнения различают следующие виды бумажной хроматографии: одномерную, двумерную, круговую и электрофоретическую . Для получения двумерных хроматограмм хроматографирование проводят дважды: после обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет проводить более тонкие разделения компонентов смеси. Специфическим приемом является сочетание БХ и электрофореза. Для этого к влажному листу хроматографической бумаги прикладывают постоянное электрическое напряжение. Дополнительное воздействие электрического поля приводит к более четкому разделению, особенно для ионов с разными зарядами. Электрофорез можно проводить одновременно с хроматографированием, а также до или после хроматографирования.
Качественный состав пробы в методе бумажной распределительной хроматографии так же, как и в ТСХ, может быть установлен или по специфической окраске отдельных пятен на хроматограмме, или по численному значению R f каждого компонента. Количественные определения в БХ выполняются по хроматографическим характеристикам (по площади пятна на хроматограмме и интенсивности его окраски) или после вымывания подходящим физико-химическим методом. Отметим, что метод бумажной хроматографии, предложенный в 1941 г. Мартином и Синджем, в настоящее время используют в аналитических лабораториях довольно редко.
Вопросы для самоконтроля
Каковы преимущества двумерной хроматографии перед одномерной бумажной или ТСХ?
Как идентифицировать пятна органических соединений в методе ТСХ?
Как выполняют количественный анализ в методе ТСХ?
Как определяют R f в методе БХ и ТСХ? От чего зависит величина R f и какие условия нужно поддерживать постоянными при проведении эксперимента?
Как можно определить концентрации компонентов смеси после разделения методом БХ или ТСХ?
Как выполняется качественный анализ с помощью плоскостных вариантов хроматографии – БХ и ТСХ?
Какими способами проба анализируемой смеси веществ вводится в хроматографическую установку в бумажной хроматографии?
Почему в методе ТСХ необходимо герметически закрывать камеру с растворителем и пластинкой во время подъема фронта растворителя?
Как обнаруживают и идентифицируют компоненты на бумажных и тонкослойных хроматограммах?
Каковы области применения, достоинства и недостатки тонкослойной хроматографии?
Хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы,
называется хроматографией на бумаге.
Неподвижной фазой является либо сама бумага, либо вещества, пред-
варительно нанесенные на ее волокна. Механизм хроматографии на бумаге может быть распределительным, адсорбционным или ионообменным. Пере-
мещение подвижной фазы происходит либо только под действием капилляр-
ных сил (восходящая хроматография), либо под действием капиллярных сил и силы тяжести (нисходящая хроматография).
При хроматографировании анализируемые вещества образуют на бу-
маге круглые или овальные пятна (зоны). Совокупность пятен, полученных при хроматографировании данного анализируемого образца, называется хро-
матограммой.
Подвижность вещества при хроматографировании характеризуется ве-
личиной R f , представляющей собой отношение расстояния от линии старта до центра пятна определяемого вещества к расстоянию от линии старта до линии фронта подвижной фазы (см. ОФС «Хроматография»).
Подлинность анализируемого вещества определяется при одновремен-
ном хроматографировании на одном листе бумаги анализируемого и стан-
дартного вещества. Если образцы идентичны, соответствующие им пятна на хроматограммах имеют одинаковый вид и равные значения R f . Для иденти-
фикации иногда целесообразно хроматографировать смесь равных количеств анализируемого и стандартного вещества. На хроматограмме должно набл ю-
даться одно пятно. Условия хроматографирования следует подбирать так,
чтобы значения R f были отличны от 0 и 1.
При испытаниях на чистоту примеси и основное вещество должны иметь разные значения R f . При этом можно судить о степени чистоты анали-
зируемого вещества по величине и интенсивности окраски (или поглощения)
обнаруживаемых на хроматограмме пятен примесей. Содержание примесей может быть определено полуколичественно. Для этого на одном листе бума-
ги одновременно хроматографируют определенное количество анализируе-
мого вещества и несколько образцов определяемой примеси (свидетеля) c
различными, точно известными концентрациями. Содержание примеси в анализируемом образце оценивают, сравнивая ее пятно на хроматограмме по совокупности площади пятна и интенсивности окраски (или поглощения) с
пятнами свидетеля. При достаточном сходстве пятен примеси по форме и ок-
раске с пятнами основного вещества, взятого в том же количестве, допуска-
ется использование соответствующих количеств основного вещества в каче-
стве свидетеля.
Для количественного анализа применяют спектрофотометрические или видеоденситометры. Для обработки хроматограмм в видимой области спе к-
тра целесообразно использовать планшетные сканеры и соответствующее программное обеспечение.
Можно также провести количественное определение веществ после их экстракции с хроматограммы. Для этого пятна вырезают и экстрагируют оп-
ределяемое вещество. Содержание анализируемого вещества в извлечении или сухом остатке после отгонки растворителя находят любым методом,
пригодным для определения малых концентраций.
ОБОРУДОВАНИЕ
Для проведения хроматографии на бумаге используют герметизиро-
ванные камеры, изготовленные из инертного материала и позволяющие на-
блюдать за ходом процесса разделения при закрытой крышке камеры. Часто в качестве камер используют стеклянные стаканы или цилиндры с пришли-
фованной крышкой и дополнительно герметизированные. На крышке могут быть входные отверстия (шлюзы) для добавления растворителя или снятия избыточного давления в камере.
При проведении нисходящей хроматографии в верхней части камеры помещают сосуд для подвижной фазы (лодочку). Лодочка должна вмещать объем подвижной фазы, достаточный для проведения, по крайней мере, од-
нократного хроматографирования. Длина лодочки должна превышать шири-
ну листа хроматографической бумаги. Камера должна быть снабжена уст-
ройствами для закрепления листа хроматографической бумаги в рабочем по-
ложении и для ввода в лодочку подвижной фазы.
При проведении восходящей хроматографии подвижную фазу поме-
щают либо в лодочку, установленную в нижней части камеры, либо налива-
ют на дно камеры.
Внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, что способствует более быстрому и полному ее насыщению парами растворите-
лей, входящих в состав подвижной фазы.
Подготовку оборудования, хроматографической бумаги и подвижной фазы приводят в частных фармакопейных статьях.
1.2. ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ (ОФС 42-0094-09)
Хроматографический процесс в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (стеклянную, металлическую или полимер-
ную), называется тонкослойной хроматографией или хроматографией в тон-
ком слое сорбента (ТСХ).
Разделение может осуществляться по нескольким механизмам: адсорб-
ционному, распределительному, ион-парному, ионообменному, эксклюзион-
ному (гель-проникающему), хиральному или какой-либо их комбинации.
В результате движения анализируемого вещества и элюента под дейст-
вием капиллярных сил происходит разделение смеси исследуемых веществ на ее компоненты. При разделении вещества образуют на поверхности сор-
бента круглые или эллипсовидные пятна или полосы (хроматографические зоны).
Подвижность вещества при разделении характеризуется величиной R f
и R s (см. ОФС «Хроматография», уравнение 6 и рис. 1.4).
Параметры R f и R s используются для идентификации веществ и для оценки разделительной способности системы.
Испытание на подлинность (идентификация) анализируемых ве-
ществ проводится при одновременном хроматографировании одинакового количества анализируемого вещества и стандартного образца на одной и той же хроматограмме. При этом если вещества идентичны, то соответствующие им хроматографические зоны имеют одинаковую форму, интенсивность по-
глощения или окраски и равные величины R f .
При испытаниях на чистоту основное вещество и примеси в условиях хроматографирования должны иметь разные значения R f . При этом можно судить о степени чистоты анализируемого вещества по величине и интенсив-
ности пятен обнаруживаемых на хроматограмме примесей. Их содержание может быть определено полуколичественно. Для этого на пластинку наносят определенные количества анализируемого вещества и свидетелей. Для опре-
деления идентифицированных примесей в качестве свидетелей используют стандартные образцы идентифицированных примесей в количествах, соот-
ветствующих их предельному содержанию. Для определения неидентифици-
рованных примесей чаще всего используют растворы сравнения, приготов-
ленные путем разведения испытуемого раствора, как указано в частной фар-
макопейной статье. Содержание примеси в анализируемом веществе оцени-
вают, сравнивая зону примеси по совокупности величины и интенсивности с соответствующими пятнами свидетеля.
Количественное определение веществ на хроматограмме проводят,
как правило, денситометрически.
Основные приборы и материалы:
– пластинки с закрепленным слоем сорбента различных модификаций;
– хроматографические камеры;
– калиброванные капилляры и микрошприцы;
– устройства для нанесения на хроматограммы обнаруживающих реаген -
тов (пульверизаторы для опрыскивания, камеры для погружения хро-
матограмм в раствор и др.);
– вещества-стандарты, растворители, реагенты для обнаружения хрома-
тографических зон;
ультрахемископы с УФ-лампами на 254 нм и 365 нм.
Используемая лампа должна удовлетворять следующему тесту.
Проверка работы лампы. На пластинку силикагель G наносят 5 мкл
0,04 % раствора натрия салицилата в спирте 96 % для ламп с максимумом и з-
лучения при 254 нм или 5 мкл 0,2 % раствора натрия салицилата в спирте
96 % для ламп с максимумом излучения при 365 нм в виде пятна диаметром около 5 мм; пятно должно светиться.
При проведении анализов расстояние между лампой и хроматографи-
ческой пластинкой не должно превышать расстояния, используемого при проверке работы лампы.
Примечание. Используемый спирт должен быть свободен от флуоресцирующих веществ.
Хроматографические пластинки
Пластинка для ТСХ представляет собой твердую подложку (стеклян-
ную, металлическую или полимерную) с нанесенным слоем сорбента. Тол-
щина слоя сорбента от 0,1 до 0,25 мм для аналитического варианта и от 0,5
до 2,0 мм для препаративного.
Готовые хроматографические пластинки могут содержать флуоресци-
рующий индикатор для детектирования веществ, поглощающих в УФ-
области спектра при 254 и 365 нм.
Размер частиц сорбента для аналитического варианта ТСХ составляет
5–20 мкм. Наряду с такими пластинками можно использовать высокоэффек-
тивные хроматографические пластинки, содержащие сорбент с частицами размером 5–7 мкм. Такие пластинки позволяют увеличить эффективность разделения и уменьшить предел обнаружения хроматографических зон.
Выпускаются также пластинки с монолитными сорбентами и пластин-
ки с концентрирующей зоной (двухфазовые пластинки). Последние исполь-
зуются в фармацевтическом анализе для разделения сложных и гетерогенных смесей (экстракты из растительного лекарственного сырья, растворы табле-
ток со вспомогательными компонентами, мягкие лекарственные формы, сме-
Хроматографические камеры
Используют хроматографические камеры для вертикального или гори-
зонтального элюирования с герметичными крышками. Камеры для горизон-
тального элюирования снабжены также устройствами для подачи элюента на пластинку. Перед проведением анализа обычно внутренние стенки камеры обкладывают фильтровальной бумагой, смоченной подвижной фазой. Для вертикального элюирования применяют камеры с перегородкой в центре дна.
Использование камеры для горизонтального элюирования позволяет осуществлять одновременное элюирование с противоположных сторон пла-
стинки, что увеличивает производительность анализа в два раза по сравне-
нию с использованием камеры для вертикального элюирования. При этом также уменьшается расход подвижной фазы приблизительно в 10 раз. В го-
ризонтальной камере движение подвижной фазы по пластинке происходит только за счет капиллярных сил, вклад гравитации при этом отсутствует, что повышает эффективность разделения по сравнению с камерами для верти-
кального элюирования.
Подвижные фазы (ПФ)
Подвижные фазы (элюенты) должны быть предпочтительно малоток-
ции ни с сорбентом (НФ, неподвижной фазой), ни с компонентами разделяе-
мой смеси. ПФ должны также достаточно быстро испаряться с поверхности хроматограмм после элюирования.
Для подавления диссоциации полярных молекул компонентов разде-
ляемой смеси к ПФ добавляют вещества кислого или основного характера
(модификаторы).
Нанесение проб
Если это указано в частных фармакопейных статьях, пластинки предва-
рительно промывают растворителем и активируют нагреванием в течение 1 ч
при 100–105 С в сушильном шкафу. Перед нанесением проб пластинки должны храниться в герметично закрытом эксикаторе. Нанесение проб осу-
ществляют:
– калиброванными капиллярами с тупым концом;
– поршневыми микрошприцами с тупым концом иглы;
– полуавтоматическими или автоматическими аппликаторами.
Нанесение осуществляют двумя способами: в виде пятен (2–5 мм диа-
метром) с промежутками между пятнами не менее 10 мм и в виде полос дли-
ной от 10 до 20 мм с промежутком между ними не менее 10 мм. Расстояние линии старта от нижнего края пластинки должно составлять не менее 10 мм.
Во избежание «краевых эффектов» размывания фронта ПФ в процессе элюи-
рования перед нанесением проб соскабливают с обеих боковых сторон пла-
стинки слой сорбента шириной 2–3 мм. Расстояния на стартовой линии от боковых краев пластинки до мест нанесения первой и последней проб долж-
ны составлять не менее 10 мм. В процессе нанесения проб недопустимо по-
вреждение сорбента на линии старта. Подсушивание нанесенных проб осу-
ществляют в токе холодного или теплого воздуха, либо на специальном столе с электроподогревом.
Способы элюирования
Используют следующие способы элюирования: восходящее элюирова-
ние (одно- и многоступенчатое, одномерное и двумерное – с поворотом пла-
стинки на 90 или 180) и горизонтальное.
Восходящая хроматография
Если не указано иначе в частной фармакопейной статье, пластинку с нанесенными пробами помещают вертикально в камеру, предварительно на-
сыщенную парами ПФ в течение 1 ч при 20–25 С. Уровень ПФ должен быть расположен ниже линии старта. Камеру закрывают и проводят процесс при
20–25 С в защищенном от света месте. После прохождения фронта ПФ рас-
стояния, указанного в частной фармакопейной статье, пластинку вынимают из камеры, сушат и проявляют в предписанных условиях.
При проведении двумерной хроматографии пластинку высушивают после хроматографирования в первом направлении и хроматографируют в направлении, перпендикулярном первому.
Горизонтальная хроматография
Пластинку с нанесенными пробами помещают в камеру и направляют по-
ток ПФ из лотка в камеру согласно инструкции к прибору для горизонтального элюирования. Процесс проводят при 20–25 С (если это указано в частной фар-
макопейной статье, одновременно с противоположных сторон пластинки). Ко-
гда ПФ пройдет расстояние, указанное в частной фармакопейной статье, пла-
стинку вынимают, сушат и проявляют в предписанных условиях.
Двумерную хроматографию выполняют как указано в разделе «Восхо-
дящая хроматография».
Способы обнаружения
Обнаружение (детектирование) хроматографических зон после прове-
дения качественной и полуколичественной ТСХ осуществляют следующими способами:
– наблюдением под УФ-светом;
– опрыскиванием растворами обнаруживающих реагентов;
– выдерживанием в парах обнаруживающего реагента;
– погружением в растворы обнаруживающих реагентов в специальных камерах.
Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ)
Эффективность разделения увеличивается как вследствие увеличения площади раздела подвижной и неподвижной фазы за счет уменьшения диа-
метра частиц сорбента, так и благодаря большей однородности размеров этих частиц. Применяют ВЭТСХ-пластинки, выполненные как в нормально-
фазовом (полярная НФ), так и в обращенно-фазовом (неполярная НФ) вари-
По сравнению с классической ТСХ использование высокоэффективных пластинок позволяет:
– увеличить число анализируемых проб за счет уменьшения диаметра стартовых пятен (до 1–2 мм) или длины полос (до 5–10 мм);
– уменьшить промежутки между стартовыми пятнами (до 5 мм);
– уменьшить время хроматографирования за счет уменьшения пробега фронта подвижной фазы (ПФ);
– уменьшить расход (объем) ПФ;
– снизить пределы обнаружения пятен и количественного определения определяемых веществ в 10–100 раз.
Применение ВЭТСХ обеспечивает получение более компактных пятен разделяемых соединений, что улучшает метрологические характеристики коли-
чественного определения с помощью сканирующей хроматоденситометрии.
ГОСТ 28365-89
Группа Л59
МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ
РЕАКТИВЫ
Метод бумажной хроматографии
Reagents. Method of paper chromatography
МКС 71.040.30
ОКСТУ 2609
Дата введения 1991-01-01
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. ВНЕСЕН Министерством химической промышленности СССР
2. Постановлением Государственного комитета СССР по управлению качеством продукции и стандартам от 13.12.89 N 3708 стандарт Совета Экономической Взаимопомощи СТ СЭВ 6397-88 введен в действие непосредственно в качестве государственного стандарта СССР с 01.01.91
3. ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Номер пункта |
|
5. ПЕРЕИЗДАНИЕ. Май 2008 г.
Настоящий стандарт распространяется на химические реактивы и устанавливает метод проведения испытания, основанный на бумажной хроматографии.
Термины, применяемые в стандарте, и их пояснения приведены в приложении 2. Рекомендуемые области применения метода приведены в приложении 3.
1. ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ
1. ОБЩИЕ УКАЗАНИЯ
1.1. При проведении испытаний должны быть соблюдены требования ГОСТ 27025 .
1.2. В нормативно-технической документации на испытуемый реактив должны быть указаны следующие данные:
1.2.1. Описание приготовления испытуемого раствора.
1.2.2. Предварительная обработка (при необходимости).
1.2.3. Используемые растворители (или смесь).
1.2.4. Применяемые реактивы и растворы.
1.2.5. Способ хроматографирования.
1.2.6. Тип хроматографической бумаги, необходимость предварительной пропитки бумаги, пропитывающие растворы, продолжительность сушки после пропитки (при необходимости).
1.2.7. Время насыщения хроматографической камеры парами подвижной фазы.
1.2.8. Объем испытуемого раствора, наносимый на бумагу.
1.2.9. Температура, при которой проводят хроматографирование (при необходимости).
1.2.10. Критерии окончания процесса хроматографирования.
1.2.11. Способ проявления хроматограмм и реагенты для проявления (при необходимости).
1.2.12. Способ оценки хроматограмм.
1.2.13. Вещества сравнения, используемые для оценки (при необходимости).
1.2.14. Аппаратура для количественной оценки разделенных компонентов (при необходимости).
2. СУЩНОСТЬ МЕТОДА
Метод заключается в разделении на хроматографической бумаге смеси веществ в потоке растворителя, основанном на различной скорости перемещения компонентов смеси.
3. АППАРАТУРА И МАТЕРИАЛЫ
3.1. Камера (сосуд) хроматографическая, закрытая герметичной крышкой.
3.2. Лампа ультрафиолетовая для обнаружения веществ с использованием флуоресценции при длине волны от 254 до 366 нм.
3.3. Микропипетка вместимостью 0,002-0,010 см или микрошприц вместимостью не более 0,01 см.
3.4. Пульверизатор для распыления проявителя.
3.5. Бумага хроматографическая.
3.6. Денситометр.
3.7. Устройство для сканирования пятен на бумаге.
4. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ
4.1. Подготовка хроматографической бумаги
В зависимости от размеров хроматографической камеры из хроматографической бумаги вырезают полоски с ровной или зубчатой кромкой или кружки соответствующих размеров, на которых мягким карандашом обозначают пробу, систему растворителей, дату и линию старта с точками для нанесения пробы. Рекомендуемое расстояние между точками для нанесения пробы 20-30 мм, расстояние от линии старта до кромки бумаги - 30 мм.
При необходимости перед испытанием бумагу обрабатывают специальным раствором и высушивают при комнатной температуре в вертикальном положении стартом вниз.
4.2. В точки, отмеченные на линии старта, наносят с помощью калиброванной микропипетки или микрошприца 0,002-0,010 см испытуемого раствора, если в нормативно-технической документации на испытуемый реактив нет других указаний. При необходимости в точки на линии старта наносят таким же образом растворы веществ, соответствующих предполагаемым компонентам смеси, для идентификации и количественной оценки этих примесей. Допускается наносить пробу не в виде точки, а чертой с применением микропипетки или капилляра. После нанесения пробы на непропитанную бумагу растворителю дают свободно испариться. Если проба не содержит летучих компонентов, а бумага не пропитана органической неподвижной фазой, испарение растворителя можно ускорить струей горячего воздуха. Бумагу с нанесенной пробой помещают в хроматографическую камеру (пропитанные бумаги помещают в камеру сразу после нанесения раствора пробы).
При круговой хроматографии пробы наносят на окружность, описанную на расстоянии нескольких сантиметров от центра хроматограммы.
5. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЙ
5.1. Хроматографирование
Хроматографическое разделение веществ проводят в хроматографической камере, в замкнутой системе, насыщенной парами подвижной фазы, при температуре, указанной в нормативно-технической документации на испытуемый реактив, поместив эту фазу в чашку на дно камеры. Если в нормативно-технической документации на испытуемый реактив нет других указаний, хроматографирование заканчивают, когда фронт подвижной фазы достигнет определенного расстояния от старта, например 250 мм. Хроматографирование проводят одним из указанных ниже способов.
5.1.1. Нисходящая хроматография
В камере для нисходящей хроматографии должен быть желобок или лодочка. Конец листа хроматографической бумаги с нанесенными пробами, ближний к линии старта, дважды перегибают, помещают в желобок или лодочку, закрепляют стеклянной палочкой, как показано на черт.5 приложения 1. Затем в желобок помещают подвижную фазу.
5.1.2. Восходящая хроматография
Хроматографическую бумагу подвешивают в хроматографической камере так, чтобы ее нижний конец был погружен в слой подвижной фазы на дне сосуда, как показано на черт.4 приложения 1, а уровень подвижной фазы находился на 10 мм ниже линии старта.
5.1.3. Горизонтальная хроматография
Испытания проводят, как показано на черт.2 приложения 1.
5.1.4. Круговая хроматография
При круговой хроматографии подвижную фазу помещают в середину хроматограммы, откуда она передвигается к периферийной части, как показано на черт.3 приложения 1. В качестве хроматографической камеры допускается использовать две чашки Петри или эксикатор.
5.1.5. Проточная хроматография
Если хроматографируемые вещества имеют в определенной системе низкие значения , нижнюю кромку нисходящей хроматограммы делают зубчатой. Когда подвижная фаза достигнет конца хроматограммы, разделение продолжают так, чтобы элюирующий растворитель стекал по каплям на дно камеры.
5.1.6. Повторная хроматография
Метод, при котором по завершении первого продвижения подвижной фазы хроматограмму высушивают и хроматографирование повторяют (возможно несколько раз).
5.1.7. Многомерная хроматография
Метод, при котором по завершении первого продвижения подвижной фазы хроматограмму поворачивают (например, под углом 90°) и снова проводят хроматографирование. Перед повторным хроматографированием испаряют подвижную фазу.
5.2. Сушка хроматограмм
По окончании разделения хроматограмму вынимают из камеры и отмечают фронт мягким карандашом, после чего сушат при комнатной температуре в вертикальном положении, стартом вниз. Продолжительность сушки зависит от скорости испарения подвижной фазы и химической стабильности хроматографируемых веществ.
5.3. Проявление хроматограмм
Проявление компонентов на хроматограмме проводят одним из способов, приведенных ниже.
5.3.1. Физические методы
Визуально, при дневном свете, отмечают на хроматограмме положение пятен - цветных веществ. При наличии флуоресцирующих веществ проявление проводят в УФ-свете.
5.3.2. Химические методы
Хроматограммы проявляют жидкими и газообразными проявителями, используя реакцию имеющихся на хроматограмме соединений с подходящим реагентом-проявителем с образованием окрашенного или флуоресцирующего вещества. Жидкие проявители наносят пульверизатором или используют реагенты в аэрозольной упаковке, газообразные применяют, поместив хроматограмму в пары проявителя.
5.3.2.1. Хроматограмму кладут горизонтально на лист фильтровальной бумаги или оставляют подвешенной на стеклянной палочке и опрыскивают как можно более мелкими каплями (туманом) проявителя всю площадь хроматограммы вначале с одной, а потом с другой стороны.
5.3.2.2. При проявлении газообразным проявителем хроматограмму подвешивают в камере, в которую помещен летучий реагент (например, кристаллы йода), или на дне которой проявитель получают химическим путем (например, оксиды азота получают путем добавления твердого нитрита натрия к раствору соляной кислоты).
5.3.3. Биологические методы
Хроматограммы проявляют, используя биологическую активность хроматографируемых веществ.
6. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ИСПЫТАНИЙ
6.1. Качественная оценка хроматограммы заключается в определении положения пятна или полосы, которое характеризуется значением .
где - расстояние от центра пятна пробы до стартовой линии, мм;
- расстояние от фронта растворителя до стартовой линии, мм,
или значением :
где - расстояние от центра пятна вещества сравнения до стартовой линии, мм.
6.2. Определение количества искомого компонента в пробе проводят путем сравнения размеров и интенсивности окраски его пятна с пятнами вещества сравнения, нанесенными на бумагу в интервале значений концентрации, указанных в нормативно-технической документации на испытуемый реактив, и обработанными в условиях испытания. Оценку проводят визуально или с помощью аппаратуры (например, денситометра, устройства для сканирования пятен компонентов на бумаге), или путем элюирования пятен и последующего фотометрического определения оптической плотности растворов.
6.3. Хроматограммы хранят в условиях, препятствующих появлению взаимных оттисков хроматограмм (например, с прокладками из фильтровальной бумаги). Если характер пятен позволяет, то на хроматограммы наносят слой быстросохнущего лака. В случае необходимости проводят зарисовку контура хроматограммы или фотографирование.
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 (справочное). ПРИМЕРЫ ОБОРУДОВАНИЯ ДЛЯ БУМАЖНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ И СПОСОБОВ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
ПРИЛОЖЕНИЕ 1
Справочное
Черт.1. Камера для восходящей и нисходящей хроматографии
Камера для восходящей и нисходящей хроматографии
Черт.2. Камера для горизонтальной хроматографии
Камера для горизонтальной хроматографии
1 - камера; 2 - решетка из стеклянных палочек; 3 - стеклянная палочка для прижатия конца хроматограммы; 4 - крышка; 5 - хроматограмма; 6 - растворитель
Черт.3. Камера для круговой хроматограммы (две чашки Петри)
Камера для круговой хроматограммы (две чашки Петри)
1 - бумажный фитиль; 2, 4 - чашки Петри; 3 - круговая хроматограмма; 5 - растворитель
Черт.4. Способы расположения хроматограммы при восходящей хроматографии
Способы расположения хроматограммы при восходящей хроматографии
1 - хроматограмма; 2 - хроматографическая камера; 3 - растворитель
Черт.5. Способ вкладывания бумажной хроматограммы в желобок
Способ вкладывания бумажной хроматограммы в желобок
1 - хроматограмма; 2 - старт; 3 - стеклянная палочка; 4 - загнутая палочка для прижатия хроматограммы в желобке; 5 - желобок
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 (справочное). ТЕРМИНЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Справочное
Термин | Пояснение |
Бумажная хроматография | Физико-химический метод разделения на хроматографической бумаге смеси веществ между неподвижной фазой на носителе и подвижной фазой |
Носитель | Хроматографическая бумага |
Неподвижная (стационарная) фаза | Фаза, закрепленная на носителе |
Подвижная (мобильная) фаза | Фаза, обеспечивающая перемещение разделяемых веществ по носителю с неподвижной фазой |
Место, на которое наносится испытуемая проба |
|
Хроматографирование | Прохождение подвижной фазы через носитель с неподвижной фазой и нанесенной пробой |
Нисходящая хроматография | Метод, при котором подвижная фаза движется вниз |
Восходящая хроматография | Метод, при котором подвижная фаза движется вверх |
Горизонтальная хроматография | Метод, при котором подвижная фаза движется горизонтально |
Круговая хроматография | Метод, при котором подвижная фаза движется из середины круга к его окружности |
Проточная хроматография | Метод, при котором продвижение подвижной фазы продолжается и после достижения фронтом конца бумаги |
Повторная хроматография | Метод, при котором по завершении первого продвижения подвижной фазы хроматограмму высушивают и хроматографирование повторяют (иногда несколько раз) |
Проявление | Способ обнаружения веществ на хроматограмме |
Величина, определяемая отношением расстояния от центра (концентрационного максимума) пятна или полосы до старта к расстоянию от фронта до старта |
|
Величина, определяемая отношением расстояния от центра пятна или полосы испытуемого вещества до старта к расстоянию от центра пятна или полосы вещества сравнения до старта |
|
Константа распределения () | Отношение концентрации вещества в неподвижной фазе к концентрации вещества в подвижной фазе: где - концентрация вещества в неподвижной фазе; Концентрация вещества в подвижной фазе |
1. Доказательство присутствия ожидаемого вещества или его примеси, оценка хроматографической однородности, проводимая в сопоставлении с известным веществом сравнения.
2. Идентификация вещества, подтверждение идентичности испытуемого вещества с известным веществом.
При данных условиях для каждого соединения характерно определенное местонахождение на хроматограмме () и определенное поведение при проявлении (окраска, флуоресценция). Идентификацию проводят непосредственным сравнением пятен известного и испытуемого вещества на одной хроматограмме или элюированием вещества из хроматограммы и последующей идентификацией, например измерением соответствующего спектра.
3. Определение одного или более веществ в смеси, проводимое одним из следующих методов:
а) субъективной оценкой хроматограммы (например, с помощью калибровочной хроматограммы);
б) объективной оценкой хроматограммы;
в) последующим определением некоторых компонентов физико-химическим методом (например, по элюировании вещества с хроматограммы его определяют спектрофотометрически).
4. Установление структуры органических соединений. Сочетанием реакций разложения с хроматографической идентификацией продуктов этих реакций можно установить структуру молекулы.
Электронный текст документа
подготовлен ЗАО "Кодекс" и сверен по:
официальное издание
Реактивы. Методы приготовления
реактивов и растворов: Сб. ГОСТов. -
М.: ИПК Издательство стандартов, 2008
